注意:残余培养液影响酶解.
3.酵母细胞壁的破除:
a.酶法:向菌体中加入 300μl Buffer SE 能,加入大约50μl Lyticase (约50U) ,充分混匀,并在摇床上 220rpm / min , 30℃处理30 min ~1小时。3000 x g离心 5 min,沉淀原生质球,小心弃去上清,收集沉淀。加入 250μl溶液S1 Resuspension Buffer(请先检查是否已加入 RNaseA ) 重悬沉淀。
注意:以上 Lyticase 的用量和处理时间为经验值,根据酵母菌株和酵母细
胞数量的不同,所用 Lyticase 的浓度和孵育时间应该进行适当调整。对于
酵母的不同菌株,孵育时间和酶量有所不同,后续操作裂解的程度取决于原生质球的数量。原生质球. 必须小心操作。
b.玻璃珠法:向菌体中加入 250μl溶液S1 Resuspension Buffer(请先检查是否已加入 RNaseA ) 重悬沉淀,彻底悬浮菌体。加入 0.1g 直径为0.45~0.55mm 的酸洗玻璃珠,涡旋振荡 10 分钟。让玻璃珠自然下沉,转移裂解液至一个新离心管.
.8. 碱裂解 将250μl溶液S2 Lysis Buffer 加入细菌重悬液,温和地上下翻转混合6~10次。
注意:此步请轻柔混合,剧烈混合如Vortex会导致基因组DNA断裂,从而污染质粒DNA。碱裂解不宜超过5分钟,否则会导致部分质粒DNA不可逆变性。
9. 中和 加入350μl溶液S3 Neutralization Buffer,立即轻柔地上下翻转混合直至蓝色彻底消失。室温放置5分钟。室温12000rpm离心10分钟。
10. 柱结合 将上述操作的上清液转移至吸附柱Spin Column中,13000rpm离心1分钟,弃滤液。
11. 漂洗 将700μl的漂洗缓冲液 Wash Buffer加入吸附柱Spin Column中,12000rpm离心30-60秒,弃滤液。
12. 再漂洗 将500μl的漂洗缓冲液 Wash Buffer加入Spin Column中,12000rpm离心30-60秒,弃滤液。 空柱12000rpm再离心2分钟,除去残留乙醇。
13. 洗脱 将Spin Column按置于新的洁净的1.5ml的离心管上,在吸附柱Spin Column膜的中央处加入30~100μl的水或洗脱缓冲液Elution Buffer,室温静置1分钟,12000rpm离心1分钟洗脱DNA,可立即用于下游分子生物学实验或-20℃保存。
注意:Elution Buffer 组成为2.5mM Tris-HCI (pH8.5),不影响测序和酶切反应,。把水或洗脱液加热于60℃使用时有利于提高洗脱液效率,如果提取的质粒>10kb,请将洗脱液预热至60℃,并适当延长洗脱时间。
质粒DNA浓度和纯度检测
OD260值为1,相当于50ug/ml的双链DNA。也可以通过DNA Marker通过琼脂糖凝胶电泳半定量。
OD260/ OD280比值一般为1.7-1.8,如果洗脱时不使用缓冲液,而使用去离子水,由于受PH值和离子浓度的影响,比值会偏低。