公司简介 产品信息 服务信息 技术资料 信息反馈 网上销售 联系我们
StarBio Cat:  产品名称检索:
产品大类
 分子生物
 免疫诊断抗原、抗体与辅料
 生化诊断用酶与辅料
 ELISA试剂盒
 生化诊断试剂盒

服务信息
 胶体金标记服务
 胶体金试纸条技术服务
 全基因人工合成服务
 基因工程操作服务
 定量PCR相关服务
 ELISA技术服务
  基因工程蛋白表达与纯化服务
 DNA解析(测序)服务
购物指南
 

固定电话:
0531-82861981

订货QQ:952893838

电话订货时间:
周一至周五9:00-17:00
电子邮件订货:
952893838@qq.com
传真订货:
0531-82861981
订单下载:
啊阿斯顿
产品目录下载:
订货须知
      首页产品分类目录分子生物克隆与表达载体→pGala-T Vector............TA Cloning专用载体

      pGala-T Vector............TA Cloning专用载体

GalaxyBio Code包装规格价格说明书购物车
FV01020ul480元

产品简介

pGala-T Vector

                    --- TA Cloning专用载体

 

Cat:FV010

    产品内容   

浓度

规格

Cat:FV011

pGala-T Vector

50ng/μl

20 μl ×1

Cat:FV012

Control Insert       

50ng/μl

10 μl×1

Cat:FV013

Solution I

 

75μl×2

贮存条件:-20保存

 

 

 

产品特点:

Ø pGala-T载体是在pUC18载体的基础上改造而成,除多克隆位点外,其余序列同pUC18

Ø 少量自连的载体产生的克隆会由于编码了LacZ基因,在IPTG/X-Gal平板上呈现蓝色克隆。大部分重组的载体,由于插入片断破坏了LacZ基因,因而在IPTG/X-Gal平板上呈现白色克隆。这样就可以通过蓝白斑非常容易地筛选出重组克隆。

Ø 构建完成的质粒可以通过质粒上的正反两个M13引物位点进行测序或通过T7 promoter上的T7引物位点进行测序。

Ø 构建完成的质粒可以利用T7 RNA polymerase promoter进行体外转录,用于探针标记等。

 

●产品说明

pGala-T Vector是一种高效克隆PCR产物(TA Cloning)的专用载体。本载体由pUC18载体改建而成,在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点,用EcoR V进行酶切反应后,再在两侧的3'端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3'末端添加一个“A”的特性,所以使用本产品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。 由于本载体以pUC18载体为基础构建而成,所以它具有同pUC18载体相同的功能。此外,本产品中的高效连接液Solution I可以在短时间内(约30分钟)完成连接反应,其连接液可以直接用于细菌转化,大大方便了实验操作。本产品中的Control Insert(500 bp)还可以用于Control反应。

●连结效率

■ Control Insert经克隆后的白色菌落中,有90%以上含有Insert DNA片段。

●用 途

■ 进行TA克隆,克隆PCR产物。

■ 对克隆后的PCR产物使用BcaBESTTM Sequencing Primers、M13 Primers进行DNA测序。

【pGala-T Vector相关位点说明】

Cloning site

459

BcaBEST Sequencing Primer M13-47 binding site

352-375

BcaBEST Sequencing Primer RV-M binding site

484-542

LacZ operator

146-510

ColE1 ori

908-1496

Amp Resistance

1632-2492

 

A)操作方法

1)在微量离心管中配制下列DNA溶液,全量为5 μl。

pGala-T Vector*1             1μl

Control Insert*2             1μl

dH2O                         3μl

2)加入5 μl(等量)的 Solution I。

3)16℃反应30分钟。

注: ① 室温(25℃)也能正常进行连接反应,但反应效率稍微降低。

② 5分钟也能正常进行连接反应,但反应效率稍微降低。

4)全量(10 μl)加入至100 μl JM109或其他感受态细胞中,冰中放置30分钟。

5)42℃加热45秒钟后,再在冰中放置1分钟。

6)加入890 μl SOC或LB培养基,37℃振荡培养60分钟。

7)在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养,形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。

8)挑选白色菌落,使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。

B)结 果

使用Control Insert时的连接/转化结果如下,使用的感受态细胞的转化效率为:1.5×108 cfu/μgp UC19 DNA。

Control Insert

连接/转化效率

(cfu/μg Vector)

白色菌落比率(%)

效率(%)*

1.7×106

98.1

90以上

1.1×105

40.4

0

 

* 效率是指白色菌落中的目的DNA Insert片段的连入效率。

 

 

 

 

 

 

■一般DNA片段的克隆实验

1)在微量离心管中配制下列DNA溶液,全量为       5 μl

pGala-T Vector*1                           1 μl

Insert DNA*3                  0.1 pmol~0.3 pmol

dH2O up to                                 5 μl

2)加入5 μl(等量)的 Solution I。

3)16℃反应30分钟。

注)① 室温(25℃)也能正常进行连接反应,但反应效率稍微降低。

② 5分钟也能正常进行连接反应,但反应效率稍微降低。

③ 长片段PCR产物(2 kbp以上)进行DNA克隆时,连接反应时间请延长至数小时。

4)全量(10 μl)加入至100 μl JM109或其他感受态细胞中,冰中放置30分钟。

5)42℃加热90秒钟后,再在冰中放置1分钟。

6)加入890 μl SOC培养基,37℃振荡培养60分钟。

7)在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养,形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。

8)挑选白色菌落,使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。

*1 pGala-T Vector的使用量

取0.5 μl实验也可得到满意的结果。实际操作时,可按实验需要确定T载体的使用量。pGala-T Vector 1μl(50 ng)的摩尔数约为0.03 pmol。

*2 Control Insert

Control Insert为500 bp的3′末端带有A碱基的PCR产物,Control Insert 1 μl(50 ng)的摩尔数约为0.15pmol。

*3 Insert DNA的使用量

在进行克隆时,Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为:1 :2~10。

 

 

●使用注意

1.Solution I请于冰水中融解。

2.克隆时使用的Insert DNA片段(PCR产物)建议进行切胶回收纯化,否则PCR产物中的短片段 DNA(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响TA克隆效率。

3. 按照本实验操作进行连接后,直接进行转化时的连接液不要超过20 μl。当要转化的DNA量较大或准备进行电转化时,需对连接液进行乙醇沉淀,纯化DNA后再进行转化。进行乙醇沉淀时使用galaxybio核酸共沉剂可以提高DNA的回收率。

4. 连接反应请在25℃以下进行,温度升高(>26℃)较难形成环状DNA。连接效率偏低时,可适当延长连接反应时间至数小时。

5. 本产品来源于pUC18载体,因此,适合pUC18载体的感受态细胞都可以使用,如:JM109等。

●相关说明

1. 感受态细胞的选择。

转化时请使用高效的热转化感受态细胞(转化效率≥1×108 cfu/μg pUC19),这样才可能得到比较理想的阳性克隆。如果需要进行蓝白筛选时,宿主细胞必须具有正确的基因型(F’编码的[LacZ△M15])产生 ω Fragment,才可能和载体DNA产生的LacZ α多肽相结合,表现出 β-半乳糖苷酶活性(α-互补性)。

2. Insert DNA的要求。

Insert DNA应该进行切胶回收的纯化处理后才进行载体连接,尽量避免引物等其它杂质的存在。切胶回时可使用galaxybio凝胶回收试剂盒。

3. Insert DNA使用量的计算方法。

进行克隆时,Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比一般为1:2~10,我们可以根据自己的实验情况选择合适的Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比。Insert DNA使用量的计算方法如下:

Insert DNA的使用量(ng)=nmol数×660×Insert DNA的bp数

本载体1 μl(50 ng)的摩尔数约为0.03 pmol。

4. 阳性克隆的检测。

DNA片段成功插入至pMD-18 Vector中后,一般情况下 β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏,重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时,基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合,克隆体也会显示蓝色菌落。有报道称,2 kbp的DNA片段插入到载体中后,重组克隆体仍显示了蓝色。所以,当我们没有得到白色菌落时,可以试着检测蓝色菌落。进行阳性克隆检测时,我们建议使用PCR的方法,扩增用引物可以使用BcaBESTM Sequencing Primers,可以对菌体直接进行PCR扩增。

为了确认实验操作的正确性以及实验试剂的有效性,我们建议进行阳性对照实验。按照实验操作方法,使用试剂盒中提供的Control Insert,可以进行10次阳性对照实验。

●Q&A

Q-1 怎样提高连接转化效率?

A-1 1. 确认Insert DNA片段的3’末端是否带有“A”尾。大部分的高保真DNA聚合酶(如:KOD、LAPower、Pfu等)扩增的PCR产物是平滑末端,不能直接进行TA克隆。

2. 纯化PCR产物。最好使用切胶回收的PCR片段,以除去PCR产物中的非特异性片段和引物等杂质。进行切胶回收时可以使用galaxybio凝胶回收试剂盒。

3. 请使用转化效率大于108 cfu/μg pUC19 DNA的感受态细胞。

4. DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下,大片段DNA的克隆效率(连接效率与转化效率)偏低,此时可以延长连接反应时间,或采用电转化方法。

5. 进行切胶回收纯化DNA片段时,不要使DNA片段在紫外线下暴露时间过长。

6. Solution I应尽量避免反复冻融。

7. 建议使用新配制的平板培养基。

Q-2 转化后的菌落全为蓝色,但有目的DNA片段的插入,为什么?

A-2 插入的DNA片段较短(小于500 bp),且插入片段没有影响LacZ基因的读框,此时平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色(或淡蓝色)。

Q-3 欲对克隆DNA片段进行测序时,使用何种引物?

A-3 本载体来源于pUC18载体。因此,用于pUC18载体测序的通用引物都可以使用。

 

 

版权所有:济南星宝生物技术有限公司
联系电话:0531-82861981,订货qq :952893838   
单位地址:济南市经十路89号    网站技术支持:QQ920626076